|   很多实验室在做细胞基因敲除之前都会先做基因敲低

但是由于shRNA的技术本身的限制无法获得基因功能完全缺失的细胞，甚至经常会出现shRNA敲低的细胞的WB效果不好，会出现敲除不干净的问题！所以，很多还是最后会选择细胞基因敲除的方法来做基因的功能的彻底敲除。那如何才能高效的做细胞基因敲除呢？我们下面从周期和方法进行比较：

|   基因敲除细胞系的流程如下：

1.  选择敲除的基因位置和构Cas9X™建敲除载体：（2周）
我们一般选择1-10kb做为基因敲除的片段大小，这个大小的效率比较合适；一般选择能够非三倍数的外显子做敲除，这样的片段敲除的同时还可以导入移码，对后续的蛋白残基的效果也更好一点；
然后就可以合成gRNA序列，通过PCR的方式将目的gRNA构建入敲除载体中，经过测序后就可以用于后续的实验；

2.  细胞的准备与转染：（2周）
Cas9X™一般使用电转的方式构建细胞敲除细胞株：一般构建敲除细胞株可以使用电转或者病毒或者脂质体的转染方式；
脂质体的参考各个公司的说明书；
如果使用电转的效率会高1倍左右；
使用Cas9X™专有的VIRUS-Free™技术的效率和用病毒的效果和基本相当（但是周期缩短一半）；
电转后经过3天的抗性药物筛选，然后就可以接着做单克隆：
a、极限稀释法：其实很简单的啊，就是把你要分离单克隆的细胞收集之后做梯度稀释，稀释到一定的倍数之后，培养，扩出来的就是单克隆了。【这种方法工作量极大，而且克隆很多都是混杂的状态】
b、克隆环法：克隆环是筛选单克隆细胞的一个简单易行的方法，用克隆环可以有效的从培养板或者培养皿等培养耗材获得单克隆细胞。【这种方法极其低效】

c、ClonePlus™方案：是Cas9X技术平台研发的专有高效细胞敲除技术，主要通过高通量电转系统和高通量的克隆分选技术结合，获得基因编辑的单细胞，其克隆形成率可以达98%，就算是克隆形成率低的细胞株也能获得敲除单克隆。【7-10天可以完成绝大部分的细胞的单克隆工作】

3.  PCR鉴定与扩增：（1周）
将ClonePlus™技术获得的单克隆接种到96孔中传代，并将细胞进行PCR鉴定，由于Cas9X™使用大片段敲除，可以直接进行PCR鉴定，无需复杂的测序和读图鉴定过程；所以一般2天完成鉴定，然后就可以将目的克隆细胞直径进行直接扩增，交付下游做RT-PCR检测，保证其mRNA的完全被敲除。

而且，为了加快速度Cas9X™使用了：

PCR-Direct™技术，可以将少量的细胞直接进行PCR鉴定，无需提取【PCR-Direct技术是针对各类生物样品组织的直接PCR技术。该技术条件下，无需对核酸进行分离提取，直接以组织样本为对象，加入目标基因引物进行PCR反应，而且样品量极少。】

RT-Shipper™技术，细胞可以无需冻存直接扩增后在室温下交付给客户，可以按照客户的需要扩增克隆细胞，从106~108都可以轻松邮寄，满足客户获得细胞就可以直接检测的需求。【可以满足从干细胞到各种肿瘤细胞的需求】

ClonePlus™技术是整个加速的核心，其中可以加速很多悬浮细胞的扩增时间周期：K562，THP-1等均非常适合。
下图是ClonePlus™技术测试的所有的肿瘤细胞的类型供各位参考：