基因功能研究，尤其是在细胞系的基因功能研究，通常是从三板斧开始的，基因干扰、基因过表达、基因敲除，今天我们来讲讲，最耀眼的基因敲除！

想必大家都听过，基因敲除和基因干扰因为很相似，往往被不明就里地混用，但实际上基因干扰只是在转录后水平上的降低基因表达，并不能像基因敲除那样完全地把基因从基因组中剔除，有时候也会因为背景不干净，导致产生的表型难以分析，如果是干扰实验，蛋白表达降不下去，表型差异出不来，就只能做敲除咯

江湖上一直流传着4+2的传说，4是四种技术手段（蛋白法、常规瞬转质粒法、病毒法、Virus-Free稳转质粒法），2是两种gRNA设计策略（移码敲除、片段敲除），亲自动手的科研"汪"，或者服务公司从4+2中混搭形成了自己的风格，十八般武艺，分外热闹。

新人小白们，面对着4+2的江湖，内心是崩溃的。师兄说蛋白法好 见效快 干净无残留；师姐告诉你 病毒法好 省事又高效；导师也有建议 说别搞那些幺蛾子 瞬转质粒价格便宜 还能药筛；实验方法让人挠头，敲除策略也不省心，A公司做移码敲除 说高效快捷成功率高，B公司做片段敲除 说稳定省心WB干净……

我们就来盘点一下这个4+2的江湖，评一评这十八般武艺

4种基因敲除的技术手段

总的来说，蛋白法不需要构建载体，最快捷，但是sgRNA容易降解，操作难度大，一般更多应用于点突变和定点插入；常规瞬转质粒法构建简单，但是效率低；病毒法效率高，但是周期长，成本更高；Virus-Free稳转质粒法稳定整合而不需要包病毒，效率高周期短，是一种很好的替代病毒的方法。

两种gRNA设计策略

这是基因敲除通用的两种方法，都能实现基因功能的沉默。

移码敲除效率高，设计简单，但是后续蛋白检测风险较大，往往会出现WB敲除不干净的现象，导致敲除变干扰；片段敲除需要双gRNA同时起作用，效率较低，但是后续蛋白检测背景干净，结果有保证，更好发文章。

结语：

4+2如何选择，取决于最终目的和周期成本预算，也取决于不同细胞不同基因的类型。有位不知名的技术专家X man说过，“像293这种细胞，我闭着眼随便做，都能拿到一堆纯合子”。最后，小海星写得这么用心，必须要打个小广告咯，对于大部分细胞系的基因敲除来说，我们的Virus-Free转座子技术结合片段敲除策略，应该是这个江湖中性价比最高的一把斧头了。