载体构建、病毒包装

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病毒常见问题汇总

海星生物对病毒包装和载体构建有多年的技术经验，针对病毒包装、载体构建我们整理了以下几个常见问题。

什么是MOI？

在微生物学中， MOI是病原体(如噬菌体或病毒、细菌等)与感染目标(如细胞)的比率。对于病毒， MOI是病毒颗粒数量与特定空间中存在的目标细胞数量的比率。通常可将某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。

如何稀释病毒？

您可使用完全培养基、PBS液等将病毒稀释到需要的滴度。如将滴度为5 x10⁹ 2TU/ml的病毒稀释到1 x10⁹TU/ml，则需取20 µl病毒液加入到80 µl的完全培养基中。

用于病毒感染的细胞接种量是多少？

根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。针对大部分细胞系：传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在20-30%左右，则72h后细胞增殖后铺板密度约在90%左右；针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50%～ 60%，但要确保在感染后3天时细胞汇合度达到90%～ 100%；针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照80%的汇合度进行接种。

如何提高病毒对细胞的感染效率？

病毒对细胞的感染效率受细胞自身生长的状态，细胞数量，细胞被病毒感染的难易程度等多个因素影响。因此保证细胞生长状态良好，轮廓清晰，合适的细胞密度，选择最优的感染条件（如合适的MOI值）可以更好的保证感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如可以在加入病毒后将细胞培养板密封，用离心机在1000g条件下离心1h，再放回培养箱中正常培养。

加入病毒病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？

病毒有一定的细胞毒性，如果培养过程中细胞出现了明显的病变或细胞状态变差，建议将转导时间缩短至5~8小时之间。或者调整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小时、 8 小时、 12小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液

细胞能被病毒感染，但为何GFP荧光很弱？

GFP病毒感染细胞后，细胞中荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类等因素。在增殖较慢的细胞中感染病毒后， GFP蛋白表达达到峰值需要较长的时间。

腺病毒载体在体外实验中应注意哪些问题？

如何确定我所用的目的细胞是否可以被腺病毒感染？

腺病毒有广泛的宿主范围,它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染，例如一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性。为了确认所使用的目的细胞是否能够被腺病毒感染，需要通过带有标记（如GFP）的腺病毒对目的细胞进行预实验。