HepG2细胞在药物作用下的相关研究中代谢酶始终保持稳定，所含有的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞同源，是体外肝细胞代谢或遗传毒性试验方面的理想的细胞系。如何在HepG2细胞株上进行基因敲除/基因敲入/基因突变也是各个课题组特别关心的问题！海星生物经过优化，可以为客户提供编辑效率高、结果稳定、周期快速的细胞基因敲除的解决方案。

|   具体的HepG2细胞基因敲除/基因敲入/基因突变的技术流程如下

整个技术流程中，构建HepG2细胞基因编辑株的难点主要在于：

HepG2细胞克隆形成率低；

HepG2细胞克隆形成慢，周期被大大延长；

HepG2细胞转染效率低，转染后存活率低；

针对以上HepG2基因编辑几个难点，海星生物进行了研发，逐一提出解决方案，为快速获得基因编辑成功的纯合克隆。具体优化包括以下方面：

1. HepG2细胞的培养条件的优化及克隆形成的优化；

HepG2属于比较好培养的细胞类型。参考ATCC推荐的培养条件，我们选择的培养条件为EMSS+10% fetal bovine serum（专门优化筛选批次）。EMSS基础培养基，海星生物自主研发配制，对渗透压进行了专门的优化，大大提高了HepG2细胞增殖的速度，也使得HepG2的细胞的形态更好。

经过细胞株的优选， HepG2细胞增殖速度和克隆形成率都远远优于普通细胞。

如培养的HepG2形态不太理想，可考虑添加1%NEAA，对于细胞状态会有所改善。正常情况下，HD加10%FBS的培养条件足矣。

2. HepG2细胞优化的电转效率和存活率：

采用Cas9X™ | 海星生物VIRUS-Free™技术对细胞进行转染，与病毒法相比，效率更高，周期更短，而且可以规避病毒重新复制的风险。

为提高转染效率，海星生物优化了电转缓冲系统。加入了吸附剂，促进DNA吸附到细胞的表面；加大的缓冲液的电阻，从而可以提供电转的电压，从而大幅度的提升了电转的效率，是传统缓冲系统的3-5倍的效率，达到80%。经过优化，细胞的存活率提升到90%，细胞的基因编辑的效率也得到了大幅提升。

                            【GFP表达载体电转后72小时对比图片】

3. HepG2细胞的快速克隆化条件优化；

HepG2细胞喜好抱团生长，克隆形成困难。按照常规方法，测定细胞的克隆形成率不足3%，形成克隆体积非常小。同时，由于克隆团并不呈规则的形状，难以判断是单个细胞扩增所得还是多个细胞抱团生长形成的克隆团。

       hepG2-克隆形成14d-200x              HCT116-克隆形成14d-40x

HepG2细胞如此低的克隆形成能力，给获得单克隆带来了巨大困难。极限稀释的方法下，要么选择一次性设立不同梯度的细胞密度，接种大量孔板，或者反复实验摸索合适的接种个数，总而言之，工作量相当巨大。尽管如此，经过漫长的3-4周的等待，仍然未必能获得足够多的用于鉴定的单个克隆。

HepG2细胞的单克隆化效率低，再加上基因定点突变效率远低于基因敲除效率，两种因素叠加导致拿到突变纯合子的概率极低。Cas9X™ | 海星生物的ClonePlus™技术, 采用专有的胶体表面处理，HepG2细胞株的克隆率超过95%，可以轻松进行克隆分离和克隆PCR鉴定，大幅提升HepG2细胞的鉴定阳性率。海星生物使用ClonePlusTM技术，HepG2的细胞克隆形成能够达到95%以上，而且克隆形成的时间可缩短到1-2周的时间，大大压缩了整个单克隆生长的时间周期，赢得宝贵的时间。

ClonePlus™技术：是Cas9X™技术平台研发的专有高效细胞敲除技术，主要通过高通量电转系统和高通量的克隆分选技术结合，获得基因编辑的单细胞，其克隆形成率可以达98%，就算是克隆形成率低的细胞株也能获得敲除单克隆，针对悬浮细胞也有更高的单克隆形成率。

VIRUS-Free™技术：是一种利用转座子进行细胞稳转株的构建和筛选的技术，以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域，能将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构，并在基因组里面的固定序列位置进行插入，从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用，并充分体现出其：低成本、高效率、基因表达稳定的特点。

4. HepG2细胞株快速特性；
市面上多数HepG2细胞质量均比较差，转染效率很低。筛选到优质的HepG2细胞是项目成功的关键因素之一。（海星生物自有的HepG2细胞已成功完成23个基因编辑项目，其中包含基因敲除和定点突变项目→点击查看）。