在血液粒细胞的研究中，THP-1是一个非常经典的细胞模型。如何在THP-1细胞株进行基因敲除/基因敲入/基因突变也是各个课题组的一个关心的问题！如何解决THP-1细胞的基因敲除，也是我们海星生物的一个重要的研发方向，经过了一年多的研发，我们终于在根本上解决了这个THP-1细胞株的基因编辑的困难，可以为客户提供编辑效率高、结果稳定、周期快速的细胞基因敲除的解决方案。

具体的THP-1细胞基因敲除/基因敲入/基因突变的技术流程如下：

1、THP-1细胞的培养条件的优化和克隆形成的优化；

在原来ATCC推荐的培养基的基础上，我们优化获得的培养基的条件如下 ：RPMI-1640 Medium，2-mercaptoethanol 0.05 mM，fetal bovine serum 10%（专门优化筛选批次），抗氧化添加物。

由于加入了抗氧化的成分，大大提升了THP-1细胞的增殖的速度和克隆形成效率，同时由于对渗透压进行专门的优化，也使得THP-1的细胞的形态更加完美。（下图是接种时与48小时后的对比）

细胞接种的密度

细胞48小时后的图片

2、THP-1细胞优化的电转效率和存活率；

由于THP-1细胞是悬浮培养，所以对很多病毒的转染效率不高，所以电转是理想的选择。依据这个细胞的特性，海星生物优化了其中的电转的缓冲液，加入了吸附剂，可以大大促进DNA吸附到细胞的表面，同时还加大的缓冲液的电阻，从而可以提供电转的电压，从而大幅度的提升了电转的效率，是传统缓冲系统的3-5倍的效率，达到80%。同时由于提升了细胞的存活率到90%，所以细胞的基因编辑的效率也得到了大幅提升。

GFP荧光电转染后

【GFP表达载体电转后72小时对比图片】

3、THP-1细胞的快速克隆化条件优化；

由于使用了ClonePlusTM技术，THP-1的细胞克隆形成能够达到95%以上，而且克隆形成的时间也缩短到1-2周的时间，大大压缩了整个克隆检测的时间周期。（而传统的克隆过程需要1个月）

悬浮细胞的病毒感染效率极低，多有死细胞且容易黏连，不利于后续筛选。因此采用Cas9X | 海星生物VIRUS-Free技术，与病毒法相比，效率更高，周期更短，而且可以规避病毒重新复制的风险。悬浮细胞与贴壁细胞相比，其药物抗性筛选难度大，单克隆化效率低，再加上基因定点突变效率远低于基因敲除效率，两种因素叠加导致拿到突变纯合子的概率极低。Cas9X | 海星生物的ClonePlus技术, 采用专有的胶体表面处理，THP-1细胞株的克隆率超过95%，可以轻松进行克隆分离和克隆PCR鉴定，大幅提升悬浮细胞的鉴定阳性率。VIRUS-Free技术：是一种利用转座子进行细胞稳转株的构建和筛选的技术，以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域，能将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构，并在基因组里面的固定序列位置进行插入，从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用，并充分体现出其：低成本、高效率、基因表达稳定的特点ClonePlus技术：是Cas9X技术平台研发的专有高效细胞敲除技术，主要通过高通量电转系统和高通量的克隆分选技术结合，获得基因编辑的单细胞，其克隆形成率可以达98%，就算是克隆形成率低的细胞株也能获得敲除单克隆，针对悬浮细胞也有更高的单克隆形成率。4、THP-1细胞株快速特性。

市面上多数THP-1细胞质量均比较差，转染效率很低。筛选到优质的THP-1细胞是项目成功的关键因素之一（海星生物自有的THP-1细胞已成功完成23个基因编辑项目，其中包含基因敲除和定点突变项目）。

海星生物基因敲除细胞株的成功案例

5、与市场上其他公司的THP-1技术服务的对比：