| CRISPR/Cas9系统广泛应用于多种细胞系基因敲除株的构建
其中最大的需求就是细胞系基因敲除，如何快速高效构建自己的敲除细胞株是很多人关心的问题。但是，实验时我们往往发现，很难获得细胞敲除纯合克隆，预期的基因敲除经常伴随着很多问题，导致克隆的阳性率往往徘徊在1%以下。
Cas9X | 海星生物带你一起了解一下具体的技术流程：
| 第一、细胞系基因敲除的细胞选择
1. 细胞先考虑肿瘤细胞，或者是有文献报道的细胞系；成功有保证！
2. 细胞系的培养基便宜，血清要求不高的优先考虑；
3. 细胞能够形成克隆，细胞增殖快速的细胞系优先考虑；
4. 细胞染色体稳定，细胞不易分化的优先考虑；
5. 慎重选择悬浮细胞效率比较低；
| 第二、细胞系敲除的基因要慎重选择
1. 原癌基因敲除后，细胞增殖会有问题，所以要考虑基因敲除对细胞株增殖的影响；
2. 抑癌基因敲除没有任何影响；
3. 细胞信号通路的有时候会导向细胞增殖停止，所以要考虑做单克隆敲除；
4. 细胞基因敲除一般选择片段敲除，慎重考虑移码，会影响后续的cDNA基因回补实验；
| 第三、细胞系基因敲除之后的鉴定分析流程
1. 做PCR检测目的基因，看看有没有完全敲除；
2. PCR产物要做测序，看看序列的实际情况；
3. mRNA检测，看看是否有敲除效果；
4. WB检测，看看蛋白的情况如何；
5. 生物学表型检测；
最后就是做拯救实验，就是将敲除的基因回补到细胞基因组！就完成了一个完整的细胞系敲除研究的所有步骤了。
