| CRISPR-gRNA文库筛选基因靶点服务
CRISPR-gRNA文库是高通量筛选靶基因的重要工具，可用于大规模或全基因组功能筛选，涉及信号通路、疾病、细胞药物应答、发育、基因调控等方面。海星生物在gRNA文库筛选方面拥有丰富的经验，能够帮助客户快速构建CRISPR KO（基因敲除）、CRISPRa（基因激活）文库、CRISPRi（基因抑制/沉默），也可以为客户提供全套的细胞功能筛选服务，涵括文库构建、病毒文库、细胞转染和筛选、NGS测序与数据分析服务。
| CRISPR-gRNA文库服务流程和优势
CRlSPR/Cas9是细菌和古生物菌用来抵抗外来入侵的一种获得性免疫系统。利用CRlSPR/Cas9技术建立的全基因组突变（基因敲除）库或者与某类功能相关的基因突变体（基因敲除）库，通过功能性筛选和富集以及随后的PCR扩增和深度测序（NGS）分析，筛选出与感兴趣的表型相关的基因的过程，被称为CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选。gRNA文库筛选是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具，可以拨开基因研究的迷雾，为研究者找出相关的基因。文库筛选是将功能基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面结合在一起，必将发挥重要价值。
CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选流程：
1. CRlSPR/Cas9 gRNA文库选择；
2. CRlSPR/Cas9 gRNA文库扩增；
3. CRlSPR/Cas9 gRNA文库慢病毒包装；
4. CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选；
5. PCR扩增和NGS测序、数据分析；
1、CRlSPR/Cas9 gRNA文库选择
首先客户选择所需gRNA文库。如果客户根据具体需要提出文库定制，我们将根据客户提供的基因群信息进行单个基因的gRNA设计，保证每个基因设计4~6个（2~3对）不同的gRNA，最大程度确保基因功能的突变。我们采用的载体是单/双载体，单载体是一个载体上同时携带单个gRNA和cas9基因，双载体是一个载体上只有单个gRNA，cas9蛋白则由单独携带cas9的载体提供。这两种模式载体均携带有额外的抗性筛选标记。
服务优势：设计文库构建方案
我们拥有强大的计算机资源和优化的流程。不需要您提供备选的gRNA序列，我们可以为您全新设计。您可根据研究需要精准度和深度，选择我们经过验证的载体骨架来构建文库，如慢病毒等。对于双载体系统CRISPR文库（CRISPR载体和gRNA载体），我们还可以根据您的筛选策略，设计和构建相应的Cas9或Cas9变体表达载体，满足多种研究的需求。
2、CRlSPR/Cas9 gRNA文库扩增
经合成的片段一般较少，不足以进行文库的慢病毒包装和使用。因此，需要对上述载体进行扩增，增加总量。上述gRNA载体构建完成后，我们将这些载体按相同的比例混合成一个pool（即载体混合物），随后将载体混合库使用专用电转感受态（高效率感受态），电转扩增培养并收集菌落，并进行扩大培养，最后大规模抽提质粒，即得到了扩增后的载体混合库，也就是敲除的载体文库。
服务优势: 精准PCR扩增构建CRISPR文库
我们使用芯片合成的方法获得高质量的gRNA引物库。以引物库为模板，使用最低有效循环数进行PCR扩增，并以平均100x的覆盖率克隆到目的载体骨架上。将CRISPR文库质粒DNA转化大肠杆菌进行扩增培养后，取对数生长期的菌液制备成甘油菌进行保存。评估文库的质量，对gRNA质粒DNA库进行NGS测序分析，测序深度将达到500x覆盖率，分析出来的数据将形成报告。
服务优势：预制质粒DNA文库的扩增
我们可以接受其他来源（例如Addgene）的预制质粒DNA文库。首先我们会将质粒DNA文库转化超级感受态细胞，达到100x覆盖率，取对数生长期的大肠杆菌培养物制备成甘油菌。同时我们还会对转化后的菌落进行计数以评估gRNA实际平均数量。并将质粒DNA文库交付大提，并进行病毒包装。我们可以在转化前和/或转化后对您的质粒DNA文库进行NGS测序验证。对于您提供的质粒DNA文库，我们可以通过克隆计数保证达到100x覆盖率，但不能保证文库的多样性和均一性，因为我们无法控制您的预制质粒DNA库质量。
3、CRlSPR/Cas9 gRNA文库质粒质检、抽提、慢病毒包装
扩增后的gRNA文库进行慢病毒的包装。由于文库是由多个不同的gRNA载体混合而成，因此我们获得的慢病毒是病毒文库，但是里面的每个病毒携带单个gRNA载体。
服务优势：病毒文库的包装
对于CRISPR文库筛选，需要通过病毒（如慢病毒或腺相关病毒）将文库转到细胞中。而具体的转染的效果需要进行MOI测试，我们可以依据客户的需求进行目的细胞的病毒感染的MOI优化和摸索。
4、CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选
对筛选的目的细胞进行病毒感染预实验，得到细胞在较低的MOI时感染百分数，以确认感染时gRNA文库的病毒用量。慢病毒库以较低的MOI值感染细胞（确保每个细胞只进入一个慢病毒），随后根据实验目的而对细胞采用相应的处理，最后经过不同的筛选方式富集细胞。以耐药性基因筛选实验为例，根据前期药物IC50实验，得到药物筛选实验的处理浓度。采用高浓度药物处理感染后的细胞，经过筛选后存活的细胞则具有一定的耐药性，将此群细胞扩增并收集下来，耐药性的来源是CRlSPR/Cas9 gRNA对相应基因的修饰。
5、PCR扩增和NGS测序
对上个环节筛选中富集下来的细胞进行慢病毒载体的PCR扩增，该扩增片段包含载体所携带的gRNA序列，通过后续的NGS测序，我们可以得到富集细胞中gRNA的富集度，从而寻找到相应的基因，这些基因很有可能参与药物作用过程，因此可作为深入研究的待选基因。
服务优势：功能筛选样品NGS测序分析
功能筛选后，可以直接将基因组DNA样品寄送给我们，我们将为您制备NGS样品、高通量测序和数据分析，并在短短几周内告知您样品的gRNA的分布情况。测序完成后，我们会通过电子邮件通知您，并附带详细的数据报告。
| CRISPR文库遗传筛选的常规流程
| 服务类型介绍：
*海星生物提供现货供应，针对Human和Mouse全基因组范围的基因敲除（CRISPR KO）gRNA文库，实现全基因范围内功能基因的高通量快速筛选。
*海星生物还可以按照需求为客户设计合成靶向特定通路或者基因的gRNA订制文库。
我们还能为您提供：
客户成果
客户成果
案例分析
案例分析
Nature Genetics，A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors
美怀特海德研究所、拉根研究所和布罗德研究所的研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术找出三个有望用于治疗HIV感染的新靶标。
研究者利用CRISPR敲除筛选的策略，将影响HIV感染，同时又是细胞存活非必需的基因。一共找出5个基因，其中它三个在早前的利用RNA干扰（RNAi）的研究中并未被鉴定。
作者描述：我们的研究HIV感染的主要靶标，并找出在病毒对T细胞的感染中起着最为显著性作用的宿主基因。之前的研究已找出几种宿主依赖性因子，包括HIV侵入CD4阳性T细胞所需的两种蛋白：CD4分子、CCR5，唯一被认为治愈HIV感染的一个人就是接受来自携带这种CCR5突变的供者的骨髓移植。2008年的三项利用RNAi鉴定潜在的宿主依赖性因子的研究鉴定出800多种可能的靶标；但是这些结果很少存在重叠，提示着存在较高的假阳性。
原因是：RNAi抑制但不会完全阻断基因表达，这可能允许靶基因产生足够多的蛋白来允许HIV感染，而且它也能够抑制靶基因之外的其他基因表达，从而导致假阳性结果。利用CRISPR对源自HIV敏感性的CD4阳性T细胞的一种细胞系进行筛选，研究人员鉴定出5个基因：当让它们失活时，会让细胞免受HIV感染，同时不会影响细胞存活。
A pooled, genome-wide CRISPR screen for HIV HDFs. (a) Outline of the genome-wide CRISPR screen strategy. WT, wild type; KO, knockout.
(b) Flow cytometry analysis (representative of five independent experiments) of cells infected with the HIV-1 strain JR-CSF and expressing GFP as a
reporter of productive HIV infection. Where indicated, cells were transduced with sgCCR5 or an sgRNA that does not target protein-coding sequences
in the human genome (nontargeting control). (c) Flow cytometry analysis (representative of three independent experiments) quantifying CD4 and CCR5
expression on the surface of wild-type GXRCas9 cells and GXRCas9 cells that were transduced with the genome-wide sgRNA library and serially infected
with HIV-1 strain JR-CSF. (d) Log2-transformed fold change in the abundance of the fifth most enriched sgRNA for every gene following HIV infection.
See also supplementary Figure 1 and supplementary table 1. (e) Enrichment of individual sgRNAs for three candidate HDFs and two control genes.
Values indicate log2-transformed fold change in abundance following HIV infection. Values for the uninfected group are from GXRCas9 cells that were
transduced with the genome-wide sgRNA library and cultured for 3 weeks.
Cas9X 海星生物可以为病毒感染筛选相关的靶向基因提供：全基因组的gRNA病毒、细胞株的构建、验证细胞株的敲除等成熟的技术支撑。
参考文献
参考文献
1. Park R J , Wang T , Koundakjian D , et al. A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors[J]. Nature Genetics, 2016, 49(2):193.
