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人外周血B细胞来源于骨髓,是异质性的.EB病毒 (Epstein-Barr virus,EBV)可在体外感染静止B细胞 (naive B cells),利用其潜伏基因表达产物改变B细胞生命周期,从而形成永生化B淋巴母细胞系 (B lymphoblastoid cell lines,B-LCLs),是近年来常用的B细胞永生化的有效方法.B-LCLs常被用作外周血B细胞的替代物和DNA的资源库,通过其单克隆抗体分泌功能,抗原提呈作用和相对稳定的遗传背景等广泛应用于生命科学的各个领域。

人外周血永生化B淋巴母细胞系的建立流程

一、实验流程

1. EB病毒制备

2. PBMC分离

(1) 开启水浴锅，设置温度为56℃。

(2) 抽取外周血10mL，将采血管中的血液转入50mL离心管中；

(3) 20℃，720×g 离心10min，离心机升速为4，降速为4。

(4) 用移液器吸取上层淡黄色血浆于一个新的50mL离心管中，标识。

(5) 将标识好的离心管封口膜封口，放入56℃水浴锅中，热灭活30min。

(6) 从水浴锅中取出灭活后的血浆，即可转入碎冰中冰浴15min，去除杂质。

(7) 2000×g离心10min,吸取上清到新的离心管。

(8) 用移液管将下层的血细胞与生理盐水1：1混匀，按2：1(血细胞悬液：Ficoll)将血细胞悬液缓慢加入装有Ficoll的离心管。

(a) Ficoll在使用前应放置常温回温。

(b) 滴加生理盐水混合后的血细胞悬液时，需要控制好滴加速度，不要扰乱液面分层，保持液面分层明显；如果因操作失误扰乱分层，停止滴加，待重新分层后继续。

(9) 将离心机升速降速调至1，400×g离心30min;

(10) 离心结束后，用移液管吸取中间白膜层置于新的50mL离心管中，并加入40mL生理盐水350×g离心10min洗涤2次，以去除血小板等杂质。

3. EB病毒转导

(1) 将新鲜分离的PBMC计数，按照10^6 cells/mL使用收集的EB病毒上清重悬后接种到孔板中。

(2) 预期3-4d后，总细胞群体中2%-3%的B细胞可以被EB病毒感染成功永生化。

(3) 正常培养及换液

永生化B细胞-B-LCLs

4. 永生化B细胞（B-LCL）的扩增

(1) 正常扩增细胞，使用HyCyte PBMC专用一步冻存液(无血清，非程序型)（海星生物，货号GUCP-R203）冻存细胞，密度按照2*10^6-1*10^7进行冻存。

(2) 冻存保存在-80℃过夜后转入液氮，长期保存。