Cas9-Cell Line Gene Knock-Out service（CGKO）基因敲除细胞系服务是针对各种常用的细胞系，进行基因片段敲除的技术服务。主要提供：Cas9介导的大片段基因敲除（非移码）的方式导致细胞基因功能缺失，基因敲除可以将基因功能完全消除，比RNA干扰获得的数据更加确定，没有RNA干扰残留的基因功能背景的干扰，目前越来越成为主流的基因功能研究方式。使用Cas9X可以让你轻松靶向更高分的文章！

使用Cas9的进行细胞系基因敲除的过程中发现：不同的位点不同的细胞系的效率差异很大，原因包括：不同的细胞株的基因拷贝数的差异很大（很多细胞系并非二倍体，而是混杂的多倍体），很多细胞的基因存在基因切割位点突变的问题（导致按照生物基因库设计的gRNA无法发挥作用），还有细胞无法获得单克隆，这些都是目前进行基因敲除的困难所在。

|   Cas9X使用新的实验模型将细胞系的敲除效率进行大幅的提升

1. 使用Cas9蛋白和gRNA的复合物直接进行电转，提高效率的同时减少非特异的切割；（目前报道脱靶率非常低的方法）
2. 使用高效的电转设备，具备更高的电转效率和细胞存活率；
3. 使用更先进的单克隆稀释设备和方法，大幅提高阳性率；（提高2倍）
4. 持续建库：我们也将提供更多的标准细胞株和基因编辑细胞株产品供科研工作者选择。
5. 大片段敲除，可以通过PCR快速鉴定；
6. 非移码方式敲除，可以保证细胞系做基因回补无需考虑突变修饰的问题。
   
通过优化，Cas9X在细胞系基因敲除的效率是传统质粒法的数倍（3-5倍）结合ClonePlus技术，可以将效率提升10-15倍，也可以针对很多之前难以实现敲除的细胞株进行基因敲除操作，而且周期比病毒法更短。快到可以5周内拿到基因敲除的细胞！

|   技术原理图 

|   技术流程图

|   细胞工作流程

|   项目名称

构建MARVELD1基因敲除的人鼻咽癌细胞C666-1 

 
实验设计
种属：Human；  基因名称：MARVELD1
gRNA位点1：ATACGCTACCTAACATGGCTGGG
gRNA位点2：CCAGCATGCAAAATACAATGGGG
 

细胞信息
种属：Human        
细胞名称：人鼻咽癌细胞C666-1              
培养基：DMEM，10%FBS                                              

细胞检测                                                            
无菌检测：合格；  支原体检测：合格       
细胞克隆形成率检测：细胞增殖能力较好，但克隆团较小。
细胞基因型检测：针对gRNA打靶位置及其附近基因组序列进行测序。测序结果与理论序列一致。                                           
                                               
细胞转导                                                            
电转参数：1350V,20ms,1次；  电转体系：10 uL           
 
PCR筛选                                                             
筛选克隆数量：170； 杂合子数量：13； 纯合子数量：2 

电泳图示例                                                       
WT：490 bp； 杂合子：490 bp； 纯合子：0 bp                                  

                                           
电泳图示例

WT：0 bp； 杂合子：~218 bp； 纯合子：~218 bp

测序结果                                                            
TAAGTCCGTGGGCTTTGCTTCCTCTTGGCCCTGGGTTTGTGTCCCAG-del 

3310 bp-TTTGCATGCTGGTCTCGAACTCCTGGGCTCAAGAGATCCTCC
 
克隆状态

|   参考文献

1. Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013).
2. Sojung Kim, D.K. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 10.1101/gr.171322.113 (2014).
3. Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biol. 2017;18(1):92.
4. Kan Y, Ruis B, Takasugi T, Hendrickson EA. 2017. Mechanisms of precise genome editing using oligonucleotide donors. Genome Research  27, 1099–1111.