Cas9-Cell line Gene Mutation service（CGM）基因点突变细胞系是细胞基因研究方法中非常有用的一个手段，可以在细胞内原位对点突变的功能进行研究。在细胞系上实现高效的转染是实现基因点突变的前提；提高效率要解决问题是：Cas9切割位点与“点突变”位点之间距离导致点“点突变”效率大幅下降的问题，还有“点突变”载体的选择问题。

目前使用Cas9的引入基因“点突变”的具体实验实践中的“单碱基突变”的效率仍然受到很多要素的影响，例如是否在点突变附近是否存在有合适的gRNA切割位点、切割位点和突变位置之间距离、不同细胞系之间的Cas9切割活性效率差异的问题、还有细胞株是否存在“假基因”和基因“多拷贝”的问题导致无法获得纯合的问题等等。

Cas9X针对不同单碱基突变的情况使用不同的Mutation载体策略：包括短同源臂可以使用Oligo引入突变，需要长同源臂的使用ssDNA引入突变。而针对难以操作的细胞系，将需要通过先构建Cas9稳转细胞株再进行gRNA和载体共转染来提高效率。Cas9X针对每个具体的位点、每个具体的细胞优化实验条件用来满足不同细胞系和不同位点突变的服务需求。

|   技术原理图：

|   技术流程图：

|   项目名称

构建Ret 基因点突变(E623K)的小鼠胚胎干细胞
 
实验设计：
种属：Mouse； 基因名称：Ret   突变信息：E623K（GAG to AAG）

WT序列：
gccagggcattaaagcaggctacggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcGAGCCAGAGga 
cagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacctcccctaaccctcaagggagtt
gRNA位点序列：GAAATGCTTCTGCGAGCCAGAGG

oligo序列：
ggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcAAGCCAGAAgacagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacc

MT序列：
gccagggcattaaagcaggctacggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcAAGCCAGAAga 
cagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacctcccctaaccctcaagggagtt

备注：在E623K（GAG to AAG）基础上，引入同义突变E625E (GAG to GAA)防止发生gRNA位点被再次切割。

细胞信息

种属：Mouse； 细胞名称：胚胎干细胞
 
细胞检测
无菌检测：合格； 支原体检测：合格
细胞克隆形成率检测：细胞增殖能力较好，克隆形成率较好。
细胞基因型检测：针对gRNA打靶位置及其附近基因组序列进行测序, 测序结果与理论序列一致。
 
细胞转导
电转参数：1400V, 20ms, 1次； 电转体系：10 uL
 
PCR筛选
筛选克隆数量：185； 杂合子数量：19；纯合子数量：3 

电泳图示例                                                       
WT：500 bp； 杂合子：500 bp； 纯合子：500 bp

测序结果 
gccagggcattaaagcaggctacggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcAAGCCAGAAga
cagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacctcccctaaccctcaagggagtt
 
克隆状态

|   参考文献

1. Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013).
2. Sojung Kim, D.K. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 10.1101/gr.171322.113 (2014).
3. Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biol. 2017;18(1):92.
4. Kan Y, Ruis B, Takasugi T, Hendrickson EA. 2017. Mechanisms of precise genome editing using oligonucleotide donors. Genome Research  27, 1099–1111.
5. Paquet, D., Kwart, D., Chen, A. et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature 533, 125–129 (2016) doi:10.1038/nature17664