|   ClonePlus™细胞基因敲除

做过细胞研究的科学家都了解，细胞单克隆是一个非常不好做的实验，因为不是每种细胞都能够长单克隆，而且很多能够形成克隆的细胞的单克隆形成率很低（低于5%也是很常见的）。

如果放到细胞基因编辑（细胞基因：敲除 | 敲入 | 突变 ）这个领域里面一个最大的限制瓶颈就是：细胞的克隆形成率！

如果我们通过简单的数学模型来重现这个过程就知道克隆形成率有多么的重要：

KO Rate%=基因编辑效率%（E）细胞基因拷贝数（N）x 克隆形成率%（C）；
由于基因编辑效率%（E）是一个固定的常数：只和基因的 位置，基因功能，gRNA的选择，选择的方法论等有关；
细胞基因拷贝数（N）：不同的细胞株，不同来源的细胞的克隆拷贝数不一样，很多细胞都不是二倍体；
所以克隆形成率（C）：直接影响到敲除效率的高低，也是基因编辑效率高低最为直接的一个系数；

ClonePlus™是Cas9X™平台研发人员经过两年时间研究，从而彻底解决了细胞克隆形成率和基因编辑效率之间的影响，C系数被固定在：0.98-1，从而大幅的提升了基因编辑和基因敲除的有效率，大幅加速了服务的过程。

主要的技术方式包括
1、筛选稳定的细胞株作为主要服务使用的细胞株：Cas9-100™细胞库就是为了这个目的建立的；
2、筛选更加高效的克隆形成培养基和培养表面的粘附材质，直接解决了克隆形成的问题；

由于Cas9X™平台使用的都是片段敲除，主要优势是：大片段的DNA缺失，导致mRNA表达消失，从而保证了Western Blot更加问题（很多做移码敲除，最后都会出现WB的鉴定分析困难）。而要更好的维持片段敲除，单克隆化是必须的工具，ClonePlus™正是我们平台解决该难题的核心技术。虽然研发过程充满了困难，但是现在我们终于可以为客户通过高效、快速、有保证的服务，也是我们的骄傲。

|   细胞流式检测服务

1. 细胞表面标记检测服务
流式细胞术（FCM）已广泛地应用于基础研究，并逐步进入临床检测，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞。细胞表面标记主要包括表面受体和表面抗原，对细胞表面标记的检测已广泛用于基础、临床免疫学研究和患者免疫功能的测定，如对间充质干细胞表面标记检测。

2006年国际细胞治疗协会（ISCT）规定了间充质干细胞的最低鉴定标准：
基本条件下贴壁生长
表达CD105、CD73、CD90，

不表达CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79a/ CD19、HLA-DR；
体外可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞。
采用细胞表面标记抗体试剂盒对不同的间充质干细胞进行流式鉴定。

图1  Human MSC检测指标分别有CD105（+）、CD29（+）、CD73（+）、CD34（-）、CD45（-）、CD11b（-）、CD44（+）
 

2. 细胞凋亡检测服务
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。通常使用细胞凋亡检测试剂盒，如常见的Annexin V荧光双染法，其检测原理为：Annexin V/ Annexin A5为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。PS存在于正常细胞浆膜的内层，但在凋亡早期，膜不对称性丧失，PS易位至细胞表面。荧光标记的 Annexin V可与之特异性结合，表明该细胞为早期凋亡细胞。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。

图2  活细胞比例约88.14%，凋亡早期细胞约1.68%，
凋亡晚期或坏死细胞约2.66%，裸核细胞约7.53%

3. 细胞周期检测服务
碘化丙啶(Propidium，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片段在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。 

图3  细胞周期拟合图

Cas9X拥有自有流式检测和流式分析分选平台，

可以为膜蛋白基因敲除的客户提供膜蛋白流式检测和细胞分选富集服务。

|   细胞克隆形成率检测服务

由于不同细胞各种生长特性都具有较大差异，因此对于需单克隆化的细胞，早期要鉴定其克隆形成的能力。我们在收到客户提供的细胞之后会马上安排进行细胞克隆形成能力的检测，是后续实验顺利进行的最重要的保证。
将目的细胞分别按照50、100、200个的数量接种至培养器皿中，通常需经过14天的培养周期，则可观察目的细胞形成克隆的情况。根据结果判断目的细胞单克隆化的难易程度，这对选择后续的实验方法具有很重要的指导意义。同时在选择细胞进行实验的时候也要关注所选的细胞株的克隆形成率数据。

图1  目的细胞培养14天后克隆形成情况

目的细胞单克隆形成能力的主要判断依据如下
1. 克隆数量：克隆形成率优良的最主要的判断依据。
2. 大克隆数量：判断筛选克隆时实验操作的难易程度。
3. 形成可观克隆的天数：若周期14天内形成可观克隆，则判断目的细胞形成单克隆能力好；超过14天才形成可观克隆，或者始终无法形成克隆的，则目的细胞形成单克隆的能力差。

如遇克隆形成能力差的情况，会影响总体实验的进度，必要时会建议更换细胞进行实验。

|   细胞基因序列检测服务
细胞株在传代的过程其染色体会不断的断裂和变化，导致其很多目的基因的位置和基因库的信息会出现差异，为了保证稳定的基因编辑效果，我们会对细胞株的基因编辑位点进行测序，确保gRNA能够发挥作用，排除由于基因突变导致gRNA失活的问题。
根据gRNA打靶位置基因组序列设计上下游引物，提取野生型细胞基因组进行PCR。将PCR产物送测序，判断目的细胞基因型是否正确，便可以判断该gRNA是否与该细胞株匹配。
同时可以保留本次使用的引物，用于打靶修饰后的阳性细胞PCR鉴定是否有敲除效果。
基因型检测的周期为7天。

gRNA-A1的位置序列：
CCGATGAGAAGCAGCGCTGAGGACTTGAAGTAGAGGGAGGAGGGCAGGCCTCGGAGCAGCGGGAGCAGCGGGA

gRNA-A2的位置序列：
TTCCCTGTCGAGAGCTAGACGTGGACAGGCGCCGCCGCGTAGATCCGGGGGAGGCTCCCAAATTGGAACCAGT

图1  根据gRNA打靶位置及其附近基因组序列设计上下游引物

如上图所示：所有的序列均与预测效果一致，该gRNA和细胞可以用于后续的实验。

|   细胞株支原体检测服务
体外培养环境中，细胞自身没有抗污染的能力，即使培养基会添加抗生素，抵抗污染的能力也很有限。常见的微生物污染为细菌、真菌、支原体和病毒等，其中又以支原体污染最为普遍棘手。一旦污染了支原体的细胞将无法正常形成单克隆，而且细胞转染过程容易死亡，细胞实验效率极低。为了维持实验的稳定，必须对所有的实验使用到的细胞进行支原体的检测。
支原体污染后，细胞不会有明显的死亡现象，且支原体通常能与细胞长期共存，培养体系亦无浑浊现象，然而实际上却可能存在细胞形变，DNA合成受抑制等诸多问题，并且即使发现支原体污染也较难彻底清除，因此确保细胞在实验初期无微生物污染是至关重要的。
采用PCR法对目的细胞进行细菌、真菌和支原体等检测。以微生物16（18）SrRNA基因为靶基因，设计通用引物并建立PCR扩增体系。

如常用的两个针对16S rRNA基因的通用引物对为27F, 1492R和63F, 1387R。
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'
63F：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’；1387R：5’-GGGCGGTGTACAAGGC-3’

图1  细胞样品为PCR阳性，将PCR产物送测序，经BLAST比对为牛支原体

研究调查表明，约有20多种支原体能污染细胞（尤其是传代细胞），95%以上是牛源性，常见为口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.Hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（A.laidlawii）。

通用的快速基因诊断技术，经大量实验证实，能保证所选引物具有良好的保守性和特异性，重复性好且操作简单，相较于传统的微生物培养法，能有效地缩短实验周期至3天，达到快速反馈检测结果的目的。

我们能为您提供：

• 细胞检测技术服务

• 体内PDX研发服务

• 肿瘤免疫研发服务

• 干细胞研发服务

• 体外细胞研发服务